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Identifizierung von Schimmelpilzen und Algen mit der MALDI-TOF Massenspektrometrie

Angefertigt von: Doreen Leske

  1. Gutachter: Prof. Dr. C. Cordes
  2. Gutachter: Prof. Dr. I. Schellenberg

Schimmelpilze sind in der Natur allgegenwärtig. Die Besonderheit dieser Mikroorganismen begründet sich in ihrer erstaunlichen Anpassungsfähigkeit an ihre Umgebung. In Luft und Niederschlag abgelagerte Substanzen dienen als Nahrungsquelle der Organismen. Im Falle einer Extremsituation, bspw. bei Trockenheit, sind die meisten Pilze in der Lage eine bestimmte Zeit diese Phase zu überstehen. In Form von Dauerstadien, sog. Sporen, sind sie überlebensfähig. Ein Kontakt mit Feuchtigkeit lässt die Organismen rasch wieder in eine aktive Form übergehen.  Die Problematik des Vorkommens von Schimmelpilzen liegt vor allem in ihren Stoffwechseleigenschaften. Sie verursachen Schäden an Materialien, Gebäuden und auf Oberflächen. Es siedeln sich meist mehrere Arten gemeinsam in diesen Umgebungen an. Neben Schimmelpilzen sind auch Algen an Gebäudefassaden und Baustoffen zu finden. Einige Vertreter gehen mit Schimmelpilzen eine Symbiose ein. Hier profitieren die Mikroben gegenseitig von Stoffwechseleigenschaften des jeweiligen Symbiose-partners. Folge dieser Stoffwechselaktivitäten sind wiederum Zerstörungen auf und in Materialien. Ein großer Schwerpunkt stellt das hohe Gesundheitsrisiko, ausgehend von einigen Schimmelpilzarten, dar. Sie können beim Menschen, Tieren und Pflanzen Krankheiten verursachen. Durch Sporen von Schimmelpilzen, die sich in der Luft befinden, können Allergien und Atembeschwerden beim Menschen ausgelöst werden. Am gefährlichsten wirken sich die von Schimmeln gebildeten Stoffwechselprodukte, die Mykotoxine, aus. Eine orale Aufnahme von Lebensmitteln, welche Mykotoxine enthalten, kann zu schweren Leber- und Nierenschäden beim Menschen oder Tieren führen.
Resultierend aus den pathogenen Eigenschaften der Schimmelpilze ist die Gewinnung von Informationen über das Ausmaß und die Zusammensetzung Gegenstand zahlreicher Analysen. Heute gibt es im Bereich der medizinischen Diagnostik DNA-analytische Untersuchungen zur Identifikation dieser Organismen. Die PCR und Real Time PCR haben sich als molekularbiogische Verfahren im Laufe der letzten Jahre etabliert. Eine neue alternative Methode zur Identifikation von Mikroorganismen ist die MALDI-TOF Massenspektrometrie. Mit diesem Analyseverfahren ist es möglich innerhalb einer kurzen Zeit, nach einfacher Probenvorbereitung, unbekannte Biosubstanzen zu untersuchen. Hierzu existieren derzeit umfangreiche Datenbanken mit gesammelten Informationen über medizinisch relevante Schimmelpilze. Im Rahmen aktueller Forschungsansätze ist die Pilz-Diagnostik auch außerhalb der medizinischen Sichtweise von großer Bedeutung. Eine Screeningmethode für schimmelpilzbefallene Gebäude oder Mykotoxin enthaltene Lebens- und Futtermittel sind als Routinediagnostik zu nennen. Im Bereich des Umweltschimmels sind derzeit kaum Daten in Form einer Datenbank erfasst. Auf diesem Gebiet ist es daher von großer Wichtigkeit zukünftig Analysemethoden zu entwickeln, die eine schnelle Identifizierung von Umweltsubstanzen ermöglicht.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist es, Schimmelpilze und Algen mittels der MALDI-TOF Massenspektrometrie im Umweltbereich zu identifizieren. Die gewonnenen Daten sollen in eine Datenbank (SARAMIS) integriert werden. Analog zur Erstellung der Massenspektren müssen die Mikroorganismen anhand ihrer DNA-Fingerabdrücke eindeutig zugeordnet werden. Dies wird im Rahmen einer PCR-Amplifikation mit anschließender DNA-Sequenzierung realisiert. Hier steht die Entwicklung einer Methodik hinsichtlich der Zellaufschlüsse zur DNA-Isolierung im Vordergrund. Weiterhin spielen Aspekte wie Auswahl spezifischer Oligonukleotide für die Amplifikation der Algen eine Rolle, da hierzu kaum wissenschaftliche Publikationen zugrunde liegen. Die Arbeit dient als Grundlage, um aus verschiedenen Umweltisolaten Massenspektren von Schimmelpilzen und Algen zu gewinnen. In Verbindung mit einer DNA-Sequenzierung soll zukünftig die Datenbank erweitert werden, um unbekannte Mikroorganismen aus verschiedenen Umweltisolaten anhand ihres genetischen Fingerabdrucks eindeutig zu identifizieren.