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Entwicklung einer real time-PCR-Methode mit spezifischen TaqMan-Sonden zur Quantifizierung von endophytischen Trichodermapilzen in Tomatenwurzeln

Angefertig von: Michaela Ferstel

  1. Gutachter: Prof. I. Schellenberg
  2. Gutachter: Prof. J. Geistlinger

Im Rahmen dieser Bachelorarbeit wurde eine real-time PCR-Methode entwickelt mit spezifischen von RAPD-, bzw. SSR-Fragmenten abgeleiteten Primern und TaqMan-Hybridisierungssonden, um endophytische Trichodermapilze in Tomatenwurzeln nachweisen zu können.
Ziel der Arbeit war es diese Screening-Methoden zunächst in künstlich erstellten Pilz-Systemen zu optimieren, um sie anschließend auf Wurzelproben, die mit Trichoderma spp.-DNA beimpft wurden, anwenden zu können.

Für die künstlichen Pilz-Systeme wurden Trichoderma virens– und Trichoderma harzianum-DNA-Extrakte aus Pilzkulturen und Tomaten-DNA aus Blattmaterial verwendet.
In insgesamt 60 Versuchen, mit 15 verschiedenen Reaktionsansätzen und 16 verschiedenen Zeit-/Temperaturprofilen wurden sechs verschiedene Screening-Methoden für das künstliche System geprüft. Vier davon befassten sich mit dem Screening der Trichoderma virens-DNA. Hier wurden spezifische, von RAPD-Fragmenten abgeleitete Primer, sowie später außerdem eine passende von RAPD-Fragmenten abgeleitete TaqMan-Sonde verwendet. In einem weiteren Screening wurden für die Trichoderma virens-DNA spezifische von SSR-Fragmenten abgeleitete Primer verwendet. Ebenso wie eine passende, von SSR-Fragmenten abgeleitete TaqMan-Sonde. Beim Screening auf Trichoderma harzianum-DNA wurden analog zu Trichoderma virens spezifische, von RAPD-Fragmenten abgeleitete Primer und in einer weiteren Screening-Methode eine passende von RAPD-Fragmenten abgeleitete TaqMan-Sonde eingesetzt. Mit diesen wurde ein künstlich erstelltes System aus 100ng/µl Tomaten-DNA und verschiedenen Konzentration der Trichoderma-DNA getestet. Für die Auswertung der verschiedenen Screening-Methoden wurden insgesamt sieben Standardkurven erstellt, vier davon können mit einem Bestimmtheitsmaß von R2 ≥ 0,99 als Eichkurven verwendet werden.

Diejenige Screening-Methode für Trichoderma virens und Trichoderma harzianum, welche am besten optimiert werden konnte und die zuverlässigsten Ergebnisse lieferte, wurde für die Versuche mit den beimpften Wurzelproben verwendet, um hier die jeweilige DNA quantifizieren zu können. Diese Tests lieferten jedoch keine Ergebnisse, so dass davon auszugehen ist, dass in den beimpften Wurzelproben keine nachweisbare Konzentration der Trichoderma-DNA enthalten ist.